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尊龙凯时 - 人生就是搏!分子生物学服务项目

质粒制备（准备）
亚克隆 
ORF克隆
基因突变
分子诊断

质粒构建服务流程

质粒构建过程

1、引物设计
2、目的片段选取：RNA提取、RNA反转录、PCR扩增、PCR产物纯化
3、双酶切
4、连接:1)双酶切后，可将质粒酶切产物琼脂糖电泳1-2ul;2)酶切产物液相纯化；3)20ul连接体系
5、转化
6、菌落PCR
7、测序：1)摇菌；2)送样; 3)比对 ；
8、菌种保存：菌种比对成功，则可保存菌种备用。
9、质粒提取：菌种比对成功，冻存菌种后，菌液用于提取质粒。

一、基本原理
分、切、连、转、筛

1、分：分离出要克隆的目的基因及载体。

2、切：用限制性内切酶切割目的基因和载体，使其产生便于连接的末端。
限制性内切酶：是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。
限制性核酸内切酶根据识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性分为三大类。
其中Ⅱ型酶能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内切割，产生特异性DNA片段。时DNA重组技术中常用的酶。
Ⅰ型酶：具有修饰和切割功能，无固定切割位点
Ⅲ型酶与Ⅰ型类似，能识别特异位点，但切割位点在识别位点以外
Ⅱ型酶特点：
①识别顺序一般为4－6个碱基对
②识别顺序具有180度的旋转对称性，呈完全的回文结构
③Ⅱ型酶对双链DNA两条链同时切割，可产生两种不同末端：平末端，粘末端
平末端：在识别顺序的对称轴上，对DNA同时切割形成平末端，如：SmaI  
5’－CCC GGG－3’                           5’－CCC           GGG－3’
3’－GGG CCC－5’                           3’－GGG           CCC－5’
5′突出粘末端：在识别序列的两侧末端切割DNA双链，于对称轴的5 ′末端切割产生5 ′端突出的粘性末端，如：Hind Ⅲ 
5’―AAGCTT―3’                          5’― A               5’－AGCTT―3’
3’―TTCGAA―5’                          3’― TTCGA－5’               A―5’
3′突出粘末端:与5′突出粘末端作用相反，产生3 ′端突出粘末端，如：PstI
5’―CTGCAG―3’                          5’―CTGCA－3’               G―3’
3’―GACGTC―5’                          3’―G               3’－ACGTC―5’
命名：酶来源的生物名称缩写
属名-种名-株名-发现次序
根据其来源命名。如：EcoRI来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株,I指在该菌株中分离的第一个限制
酶活单位定义：在适当的条件下（T，pH，离子强度等）一小时内完全酶解1ug特定DNA底物所需要的限制性核酸内切酶的量，定义为1个活性单位。
目前常用的酶单位的定义是：37℃ ，1小时内50ul反应体系完全酶解1ugλ DNA所需的酶量。
在建立酶切体系时，酶的用量一般为1－5U/ugDNA。
   
3、连：将切割后的目的基因和载体用T4DNA连接酶连接。
①来源：T4DNA连接酶是T4噬菌体基因30编码的产物。最早是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中提取的。分子量为68KD，。
②最佳pH7.2-7.8，常用的反应液为pH7.6的Tris－Hcl
③需要ATP作为辅助因子并由ATP提供能量
④DTT等巯基化合物可促进连接酶的连接作用
⑤高浓度的钠、钾离子等抑制酶活性

4、转：把连接好的重组载体转化入感受态细胞的过程（细菌：E.coli，真菌：Yeast，昆虫细胞或哺乳动物细胞）。
5、筛：在不同层次上、不同水平上进行筛选，鉴定所需的特异性重组子。使用各种方法，将带有重组载体的宿主菌从培养基中筛选出来。例如：载体大小，酶切结果，筛选标记等。

二、操作步骤
①酶切产物回收
1. 将单一目的DNA条带切下，放入干净的ep管中，称取重量。
2. 向胶块中加入3倍体积的溶胶液PN（如胶块重量为100mg则加入300ul溶胶液PN），50℃水浴放置10min，间隔2min翻转ep管数次，以确保胶块充分溶解。
3. 胶块完全溶解后，溶液降至室温后将液体加入一个吸附柱（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心30s，弃滤过液，将吸附柱重新放入收集管中。
4. 向吸附柱中加入700ul漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱重新放入收集管中。
5. 向吸附柱中加入500ul漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃废液，将离心吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2min。将吸附柱室温放置5min彻底晾干。
6. 将吸附柱放入一个干净的ep管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30ul洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000rpm离心1min。

②连接：连接体系一般为10-25ul，16℃连接过夜。

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